構建背景：EPO 是調控紅細胞生成的關鍵細胞因子，該亞系克隆通過載體介導（如含 EF-1α 啟動子的表達質粒）將人 EPO 基因導入 CHO 細胞，經 G418 抗性篩選及單克隆純化獲得高表達株，“T" 代表篩選得到的穩定分泌亞系，確保 EPO 產量與活性的均一性。

形態與增殖：體外培養呈典型上皮樣形態，貼壁生長，細胞呈多邊形，排列緊密，形態與親本 CHO 細胞一致。在 37℃、5% CO?條件下，傳代周期約 2-3 天，可適應含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基，兼容懸浮培養與無血清體系，高密度培養（細胞密度達 1.5×10?個 /mL）時仍能維持穩定增殖，為大規模生產 EPO 奠定基礎。

表達特征：EPO 主要分泌至細胞外培養基，表達量可達 8-12μg/（10?細胞?24h），長期傳代（＞40 代）后分泌量波動＜10%。分泌的 EPO 為糖基化蛋白，分子量約 34kDa（含 30%-40% 糖鏈），與天然人 EPO 的糖型分布高度一致，通過 Western blot 可檢測到特異性條帶，且能被 EPO 抗體中和，體外刺激紅系祖細胞增殖的活性是原核表達產物的 5-8 倍。

優勢：EPO 分泌穩定，避免重組蛋白表達的批次差異；糖基化修飾與天然 EPO 一致，體內半衰期（約 8-12 小時）接近天然蛋白，生物活性顯著優于原核或酵母表達系統；培養適應性強，可通過懸浮培養放大至生物反應器生產，降低大規模制備成本；分泌型表達便于產物純化，無需裂解細胞，簡化下游處理流程。

局限性：長期培養需維持 G418 篩選壓力（通常 500μg/mL），否則易丟失表達質粒；EPO 分泌受細胞密度與代謝狀態影響，需優化培養條件（如控制葡萄糖濃度）以保持產量穩定；作為異源表達系統，糖鏈末端唾液酸含量略低于人源細胞，雖不影響主要活性，但用于臨床級藥物生產時需進一步優化。

培養條件：基礎培養基為含 10% 胎牛血清、500μg/mL G418 的 DMEM/F12，添加青mei素 - 鏈mei素防污染。傳代時用 0.25% yi酶消化，貼壁培養融合度控制在 60%-80%，避免過度密集導致 EPO 分泌量下降。懸浮培養可采用無血清培養基（如 CHO-S-SFM II），通過生物反應器實現規模化生產，EPO 產量可達 30-50mg/L。

EPO 活性檢測：推薦使用 TF-1 細胞增殖實驗驗證活性，將培養上清與 TF-1 細胞共孵育 48 小時，通過 CCK-8 法檢測細胞活力，活性單位定義為刺激 50% 最大增殖的上清稀釋倍數，通常比活性＞1.5×10?U/mg。

凍存與復蘇：凍存液含 10% DMSO、500μg/mL G418，液氮保存可維持活性 5 年以上；復蘇時 37℃快速解凍，離心后用含篩選壓力的培養基重懸，傳代 2 次后檢測 EPO 分泌量，確保活性穩定。