ME小鼠黑色素瘤瘤株細(xì)胞系
ME小鼠黑色素瘤瘤株細(xì)胞系源自 C57BL/6 小鼠的自發(fā)性皮膚黑色素瘤，是保留黑素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征和強(qiáng)血行轉(zhuǎn)移能力的經(jīng)典腫瘤模型，在黑色素瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)制、色素合成調(diào)控及靶向治療研究中具有重要價(jià)值，為解析黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移規(guī)律提供了理想工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈梭形或多邊形，貼壁生長(zhǎng)時(shí)排列呈不規(guī)則漩渦狀或片狀，部分區(qū)域可見(jiàn)色素沉著，模擬黑素細(xì)胞的分化特征。細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，核質(zhì)比高，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，可見(jiàn) 2-3 個(gè)明顯核仁，核分裂象多見(jiàn)（每 10 個(gè)高倍視野 6-8 個(gè)），胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕黑色黑素顆粒，電鏡下可見(jiàn)黑素小體，從 Ⅰ 期到 Ⅳ 期均有分布，符合黑色素瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá)黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物 HMB45 和 Melan-A，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率分別達(dá) 90% 和 85%，同時(shí)表達(dá)腫瘤增殖抗原 Ki-67（陽(yáng)性率 75%），而角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)志物 CK10 表達(dá)陰性，證實(shí)其黑素細(xì)胞來(lái)源特性。
體外培養(yǎng)體系中，ME 細(xì)胞展現(xiàn)出旺盛的增殖能力與強(qiáng)侵襲潛能。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 48 小時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活力達(dá) 95% 以上，倍增時(shí)間約 36 小時(shí)。其顯著特點(diǎn)是血行轉(zhuǎn)移能力突出，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的數(shù)量是其他黑色素瘤細(xì)胞系的 1.5 倍，這種強(qiáng)侵襲性與其高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶 - 2（MMP-2）和 MMP-9 相關(guān)，酶活性分別是正常黑素細(xì)胞的 4 倍和 5 倍，可高效降解血管基底膜的 Ⅳ 型膠原。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 40%，克隆形態(tài)呈不規(guī)則形，邊緣有偽足樣突起，部分克隆可見(jiàn)明顯色素沉著，連續(xù)傳代 50 次后，HMB45 表達(dá)及轉(zhuǎn)移能力無(wú)明顯衰減，凍存復(fù)蘇存活率超 90%。
在動(dòng)物模型中，ME 細(xì)胞的成瘤與轉(zhuǎn)移模式j(luò)i具特點(diǎn)。接種 1×10?個(gè)細(xì)胞至 C57BL/6 小鼠皮下，7 天形成實(shí)體瘤，14 天出現(xiàn)局部侵襲，21 天肺轉(zhuǎn)移率達(dá) 70%（肝轉(zhuǎn)移率 50%），模擬人類黑色素瘤的血行轉(zhuǎn)移偏好。病理切片顯示腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)大量含黑素顆粒的瘤細(xì)胞，呈巢狀或彌漫性分布，免疫組化可見(jiàn) HMB45 陽(yáng)性細(xì)胞，肺轉(zhuǎn)移灶內(nèi)保留原發(fā)灶的色素合成能力。熒光標(biāo)記追蹤證實(shí)，細(xì)胞通過(guò)外周血循環(huán)定植于肺臟，高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 CD44v6，黏附率達(dá) 55%，CD44v6 抗體處理可使肺轉(zhuǎn)移率下降 60%。
發(fā)病機(jī)制研究揭示其du特的分子異常。基因測(cè)序顯示，細(xì)胞存在 BRAF 基因第 600 密碼子突變（V600E）和 NRAS 基因擴(kuò)增，導(dǎo)致 MAPK 通路與 PI3K/Akt 通路異常激活，Western blot 檢測(cè)顯示磷酸化 MEK（p-MEK）和磷酸化 Akt（p-Akt）水平分別是正常黑素細(xì)胞的 7 倍和 6 倍，雙通路抑制劑聯(lián)合處理可使細(xì)胞增殖率下降 80%，顯著優(yōu)于單通路抑制。與其他黑色素瘤細(xì)胞系相比，其小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）表達(dá)上調(diào) 3 倍，該因子可調(diào)控酪an酸酶家族基因表達(dá)，使細(xì)胞保持較強(qiáng)的色素合成能力，MITF 沉默后黑素顆粒生成減少 60%。
轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，ME 細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移涉及多重調(diào)控。除 CD44v6 介導(dǎo)的血管黏附外，細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4，可響應(yīng)肺組織高濃度的 CXCL12，遷移能力是 CXCR4 陰性細(xì)胞的 2.2 倍，CXCR4 拮抗劑處理可使肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少 55%。基因芯片分析顯示，轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的 Snail 和 Twist 表達(dá)上調(diào)，E - 鈣粘蛋白表達(dá)下降 50%，使細(xì)胞更易脫離原發(fā)灶進(jìn)入血液循環(huán)，Snail 沉默后轉(zhuǎn)移率下降 45%。
在藥物篩選應(yīng)用中，ME 細(xì)胞是評(píng)估黑色素瘤靶向藥物的有效模型。基于其 BRAF V600E 突變特性，對(duì) BRAF 抑制劑敏感，半數(shù)抑制濃度（IC50）約 0.5μM，藥物處理后細(xì)胞 G1 期比例增加 45%，凋亡率上升 40%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，BRAF 抑制劑口服可使 C57BL/6 小鼠皮下腫瘤體積縮小 75%，肺轉(zhuǎn)移率從 70% 降至 25%，療效顯著。其色素合成特性使其成為靶向黑素細(xì)胞藥物的理想模型，某新型酪an酸酶抑制劑可減少黑素生成，同時(shí)抑制細(xì)胞增殖，使體外殺傷率達(dá) 70%。
在腫瘤微環(huán)境研究中，ME 細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的相互作用為解析轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了線索。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，CAF 分泌的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）可激活腫瘤細(xì)胞的 c-Met 通路，使 MMP-2 表達(dá)上調(diào) 3 倍，侵襲能力增強(qiáng) 60%，HGF 中和抗體可阻斷這種促進(jìn)作用。在缺氧微環(huán)境（1% O?）中，細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）分泌增加，使腫瘤內(nèi)微血管密度增加 2 倍，VEGF 抗體處理可抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。
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