HL-60細胞之細胞培養技術指南

HL-60細胞介紹

HL-60細胞株http://www.atcccell.com/ATCCcell-Products-14206745/即人前髓細胞為白血病株（早幼粒細胞）。該細胞經過不同的處理可誘導分化為嗜中性或嗜酸性細胞，具有血細胞的一些特征。

HL-60細胞之細胞培養技術指南如下：

在培養基中補充牛胎兒血清.HEPES，抗生素類化學物質，L-谷氨酰胺，通過懸浮培養，hl-60細胞能持續增值。加倍時間大約是36-48小時。這個細胞株是在National Cancer Institute[1]（美國國家癌癥研究所）從一個36歲患急性早幼粒細胞白血病的男人身上得到的。

HL60細胞增值需要transferrin（轉鐵蛋白）和胰島素受體，細胞表面表達有這兩種物質。這兩種物質是必須的，一旦這兩種復合物任意一種從無血清培養基中除去，那么hl-60細胞立即停止增值。成熟的粒細胞自發分化可以用 dimethyl sulfoxide （DMSO）（二甲亞砜）retinoic acid（維甲酸）等化學物質誘導。其他諸如 1,25-dihydroxyvitamin D3（二羥維生素D）. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）（對二苯甲酸），GM-CSF等化學物質能夠分別誘導hl-60細胞分化出單核細胞，巨噬細胞，嗜酸性粒細胞的表型。

懸浮白血病細胞HL-60的培養上清液對HUVECs的血管形成能力的影響
1 材料與方法
1.1 材料及試劑
1.1.1 細胞培養材料： RPMI1640培養基，小牛血清，人急性白血病細胞株（Hl-60），人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）。
1.1.2 主要藥品與試劑：二甲亞砜（DMSO）；MTT，Amresco公司產品；0.25%胰酶；HEPE；逆轉錄及PCR試劑盒；瓊脂糖凝膠，美國Sigma公司產品。
2 實驗方法
2.1 細胞培養： HL-60懸浮細胞、HUVECs在含10%小牛血清的1640培養液中于5%CO2恒溫培養箱中常規培養。K562細胞每1-2天換液傳代一次，HUVECs每2-3天換液傳代一次。
2.2 MTT比色實驗檢測細胞增殖情況：取對數生長期HUVECs調整細胞濃度為1×105/ml，接種于96孔培養板，每孔100μL，每板種2組，每組十個復孔，共種3板。待4小時鏡下觀察細胞貼壁后，*組每孔加培養12h的HL-60細胞上清100μL，第二組每孔加1640培養基100μL，分別培養24、48、72h后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μL，繼續培養4h，吸去上清液，每孔加DMSO180μL，在酶聯免疫檢測儀上以570nm為檢測波長，讀取吸光度（A）值。
2.3 RT-PCR技術檢測HUVECs CyclinE及VEGF mRNA表達：a.對照組: 將HUVECs濃度調整為1×105/ml的細胞懸液,接種5ml于細胞培養瓶中，4小時鏡下觀察其貼壁后加入5ml培養基。 b.實驗組: 將HUVECs濃度調整為1×105/ml細胞懸液,接種5ml于細胞培養瓶中，4小時鏡下觀察其貼壁后加入培養12h的K562細胞上清液5ml。兩組細胞培養72h后，棄去培養瓶中培養液，PBS輕柔清洗細胞2-3次，Trizol法提取兩組HUVECs總mRNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。以逆轉錄反應產物為模板按，按照PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。根據文獻報道[3]擴增CyclinEmRNA及VEGFmRNA的引物序列，并用Oligo引物設計軟件檢測。CyclinEmRNA上游引物：5-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3，下游引物：5-CCGCTGCTCTGCTTCTTAC-3。VEGFmRNA上游引物：5-CAAATCCACCCACTATGA-3，下游引物：5-CCGCCTCGGCTTGTC-3.β-action上游引物：5-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3 ，下游引物：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反應參數為：95℃預變性5min,95℃變性40s,53℃退火35s,72℃延伸35s，共30個循環，zui后于72℃保溫10min終止反應。然后取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
2.4 統計學處理：實驗結果采用SPSS13.0統計學軟件進行統計學分析，數據用平均數±標準誤表示（means±S.E.）。多組均數間的比較采用F檢驗。以P＜0.05或P＜0.01判斷差異有統計學意義。 3 結果
3.1 K562細胞上清對HUVECs促增殖作用
噻唑藍（MTT）還原法檢測兩組培養24、48、72小時后HUVECs增殖速度（圖1）。結果顯示實驗組中HUVECs較對照組HUVECs增殖明顯加快，并呈時間依賴性， 72小時后差異具有顯著性意義（P<0.05）。



圖1 兩組培養24h、48h、72hHUVECs吸光值比較（n=10 *P<0.05） 3.2 實驗組HUVECs較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達明顯增高
實驗組、對照組培養72h后，RT-PCR檢測顯示：實驗組HUVECs較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達明顯增加。灰度掃描顯示實驗組較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達差異有顯著性意義（P<0.01）（圖2）。



圖2 RT-PCR檢測組兩HUVECs CyclinEmRNA表達水平 （**p<0.01）
3.3 實驗組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達明顯增高
實驗組、對照組培養72h后，RT-PCR檢測顯示：實驗組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達明顯增加。灰度掃描顯示實驗組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達差異有顯著性意義（P<0.01）（圖3）。




（（來源：乾思生物細胞培養網  http://www.atcccell.com/   ）