B22小鼠未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤瘤株細(xì)胞系
B22小鼠未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤瘤株細(xì)胞系源自 C57BL/6 小鼠的自發(fā)性腦內(nèi)未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤，是保留神經(jīng)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征和腦實(shí)質(zhì)強(qiáng)侵襲能力的高度惡性腫瘤模型，在未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的去分化機(jī)制、血腦屏障穿透及放hua療抵抗研究中具有重要價值，為解析這種顱內(nèi)高度惡性腫瘤的du特生物學(xué)行為提供了理想工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈圓形或短梭形，以貼壁生長為主，部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞體積較小（直徑 10-15μm），核質(zhì)比ji高，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，可見 1-2 個明顯核仁，核分裂象極為活躍（每 10 個高倍視野 12-15 個），胞質(zhì)少，呈嗜堿性，可見少量胞質(zhì)突起，電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的游離核糖體，缺乏成熟神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，符合未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形態(tài)特點(diǎn)。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物 Nestin 和 Sox2（陽性率分別為 92% 和 88%），而成熟神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)志物 GFAP 表達(dá)陰性，神經(jīng)元標(biāo)志物 NeuN 亦呈陰性，證實(shí)其未分化特性和神經(jīng)干細(xì)胞起源。
體外培養(yǎng)體系中，B22 細(xì)胞展現(xiàn)出旺盛的增殖能力與du特的侵襲模式。最適培養(yǎng)條件為含 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 20ng/mL EGF 和 bFGF，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 48 小時，對數(shù)生長期細(xì)胞活力達(dá) 95% 以上，倍增時間約 30 小時，顯著快于分化型神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。其顯著特點(diǎn)是體外可形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，懸浮生長的細(xì)胞聚集成團(tuán)，具有自我更新能力，這種特性與其高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 Oct4 相關(guān)（表達(dá)量是正常神經(jīng)干細(xì)胞的 2 倍）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，其穿透腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的能力是分化型神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的 3 倍，這種侵襲性依賴于高表達(dá)的 MMP-2 和 MMP-9，酶活性分別較分化型細(xì)胞高 4 倍和 5 倍，可高效降解血腦屏障的基底膜成分。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 50%，克隆形態(tài)呈不規(guī)則形，邊緣模糊，連續(xù)傳代 50 次后，Nestin 表達(dá)及神經(jīng)球形成能力無明顯衰減，凍存復(fù)蘇存活率超 90%。
在動物模型中，B22 細(xì)胞的成瘤與侵襲模式j(luò)i具特點(diǎn)。將 1×10?個細(xì)胞立體定向接種于 C57BL/6 小鼠大腦皮層，7 天即可形成局部腫瘤，14 天腫瘤細(xì)胞沿神經(jīng)纖維束廣泛侵襲腦實(shí)質(zhì)，21 天侵犯腦室系統(tǒng)和腦膜，成瘤率 100%，模擬人類未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的快速生長和廣泛侵襲特性。病理切片顯示腫瘤組織呈彌漫性生長，無明確邊界，大量未分化細(xì)胞浸潤正常腦組織，破壞神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，免疫組化可見 Nestin 陽性細(xì)胞廣泛分布。熒光標(biāo)記追蹤證實(shí)，腫瘤細(xì)胞優(yōu)先沿白質(zhì)束和血管周圍間隙遷移，這種遷移路徑依賴細(xì)胞表面的整合素 αvβ3 與神經(jīng)組織基質(zhì)中的玻連蛋白結(jié)合，整合素拮抗劑處理可使侵襲范圍縮小 60%。
發(fā)病機(jī)制研究揭示其te有的分子異常。基因測序顯示，細(xì)胞存在 p53 基因缺失和 PTEN 基因突變，導(dǎo)致 PI3K/Akt/mTOR 通路持續(xù)激活，Western blot 檢測顯示磷酸化 Akt（p-Akt）和磷酸化 mTOR（p-mTOR）表達(dá)量較正常神經(jīng)干細(xì)胞高 8 倍和 10 倍，使用 mTOR 抑制劑處理后，細(xì)胞增殖率下降 70%，凋亡率上升 50%，證實(shí)該通路在其惡性增殖中的核心作用。此外，細(xì)胞中 Hedgehog 信號通路異常激活，Gli1 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較正常神經(jīng)干細(xì)胞高 6 倍，可促進(jìn)干細(xì)胞特性維持和腫瘤侵襲，Hedgehog 通路抑制劑處理可使神經(jīng)球形成率下降 65%。
轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，B22 細(xì)胞的腦內(nèi)侵襲涉及多重調(diào)控。除整合素介導(dǎo)的黏附外，細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4，可響應(yīng)腦內(nèi)高濃度的 CXCL12，遷移能力是 CXCR4 陰性細(xì)胞的 2.5 倍，CXCR4 拮抗劑處理可使腦內(nèi)侵襲范圍縮小 55%。基因芯片分析顯示，侵襲性細(xì)胞中與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的 Snail 和 Twist 表達(dá)上調(diào)，E - 鈣粘蛋白表達(dá)下降 60%，使細(xì)胞更易脫離腫瘤團(tuán)塊并侵襲周圍組織，Snail 沉默后侵襲能力下降 50%。
在藥物篩選應(yīng)用中，B22 細(xì)胞是評估抗未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物的有效模型。基于其高增殖特性，對拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ 抑制劑敏感，半數(shù)抑制濃度（IC50）約 0.3μM，藥物處理后細(xì)胞周期停滯于 S 期，凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3 活性上調(diào) 6 倍。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ 抑制劑聯(lián)合放療可使 C57BL/6 小鼠腦內(nèi)腫瘤體積縮小 75%，生存期延長 60%，療效顯著優(yōu)于單藥或單純放療。因其未分化特性，還可用于篩選針對腫瘤干細(xì)胞的藥物，某新型 Notch 通路抑制劑可特異性殺傷 Nestin 陽性細(xì)胞，使神經(jīng)球形成率下降 70%。
在腫瘤微環(huán)境研究中，B22 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用為解析侵襲機(jī)制提供了線索。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的 IL-1β 可激活腫瘤細(xì)胞的 NF-κB 通路，使 MMP-9 表達(dá)上調(diào) 3 倍，侵襲能力增強(qiáng) 60%，IL-1β 中和抗體可阻斷這種促進(jìn)作用。在缺氧微環(huán)境（1% O?）中，細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）分泌增加 4 倍，促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管形成，VEGF 抗體處理可使腫瘤微血管密度減少 60%，抑制腫瘤生長。
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