L-M(TK-)小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系
L-M(TK-)小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系源自 C3H 小鼠的皮下結(jié)締組織，是經(jīng) 5 - 溴脫氧尿苷篩選獲得的胸苷激酶（TK）缺陷型細(xì)胞系，在基因重組、病毒增殖及嘧啶代謝研究中具有重要價(jià)值，尤其因 TK 缺陷特性成為 HAT 選擇系統(tǒng)的理想宿主細(xì)胞，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯技術(shù)提供了關(guān)鍵工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則星形，以貼壁生長(zhǎng)為主，排列呈放射狀或漩渦狀，細(xì)胞體積較大（長(zhǎng)徑 30-50μm），核質(zhì)比低，細(xì)胞核呈橢圓形，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，可見(jiàn) 1-2 個(gè)核仁，核分裂象每 10 個(gè)高倍視野 2-3 個(gè)，胞質(zhì)豐富，呈弱嗜堿性，可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)胞質(zhì)突起，電鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體，符合結(jié)締組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá)間葉組織標(biāo)志物 vimentin（陽(yáng)性率 98%），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示其 vimentin 表達(dá)強(qiáng)度顯著高于上皮細(xì)胞系，而上皮標(biāo)志物 CK 表達(dá)陰性，證實(shí)其純結(jié)締組織來(lái)源特性。
體外培養(yǎng)體系中，L-M (TK?) 細(xì)胞展現(xiàn)出穩(wěn)定的貼壁增殖能力與du特的代謝缺陷。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 72 小時(shí)，倍增時(shí)間約 50 小時(shí)，與正常成纖維細(xì)胞增殖速率接近。其核心特征是胸苷激酶基因（TK1）缺失，導(dǎo)致無(wú)法利用外源性胸苷合成 DNA，在含 HAT（次黃piao呤、氨基蝶呤、胸苷）的培養(yǎng)基中無(wú)法存活（48 小時(shí)死亡率達(dá) 100%），而在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常，這種選擇性存活特性使其成為基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的理想受體細(xì)胞。與野生型 L-M 細(xì)胞相比，其在含胸苷類(lèi)似物（如 5 - 氟脫氧尿苷）的培養(yǎng)基中存活率更高（達(dá) 80%，野生型細(xì)胞僅 10%），證實(shí)其嘧啶代謝途徑的du特性。軟瓊脂克隆形成率約 15%，克隆形態(tài)呈不規(guī)則扇形，連續(xù)傳代 60 次后，vimentin 表達(dá)及 TK 缺陷特性無(wú)明顯改變，凍存復(fù)蘇存活率超 95%。
在基因重組研究中，L-M (TK?) 細(xì)胞是 HAT 選擇系統(tǒng)的經(jīng)典模型。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，將含 TK 基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，僅成功整合外源基因的細(xì)胞可在 HAT 培養(yǎng)基中存活，陽(yáng)性克隆率達(dá) 30%，顯著高于其他選擇系統(tǒng)（如 G418 篩選的陽(yáng)性率 15%）。這種高效篩選特性使其廣泛應(yīng)用于基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)導(dǎo)入野生型基因可恢復(fù)相應(yīng)表型，例如導(dǎo)入 TK 基因后，細(xì)胞在 HAT 培養(yǎng)基中的存活率從 0 提升至 90%，DNA 合成速率恢復(fù)至野生型水平的 85%。與其他缺陷型細(xì)胞系（如 CHO-K1）相比，其轉(zhuǎn)染效率更高（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率達(dá) 40%），適合大規(guī)模基因文庫(kù)篩選。
病毒增殖研究證實(shí)其對(duì)多種病毒的易感特性。感染實(shí)驗(yàn)顯示，該細(xì)胞可支持單純皰疹病毒（HSV）、痘苗病毒及小鼠白血病病毒的復(fù)制，HSV 感染后 24 小時(shí)病毒滴度達(dá) 10?PFU/mL，顯著高于 Vero 細(xì)胞（10?PFU/mL）。因 TK 缺陷，其對(duì) HSV 的 TK 依賴(lài)性突變株更敏感（空斑形成率是野生型病毒的 2 倍），這一特性被用于病毒減毒疫苗的篩選。電鏡觀察顯示，病毒在細(xì)胞內(nèi)可完成完整的復(fù)制周期，HSV 感染后可見(jiàn)核內(nèi)病毒顆粒裝配及胞質(zhì)內(nèi)出芽過(guò)程，與野生型細(xì)胞相比，病毒釋放效率無(wú)明顯差異（約 50%）。
嘧啶代謝機(jī)制研究揭示其te有的補(bǔ)救途徑缺陷。酶活性測(cè)定顯示，細(xì)胞內(nèi)胸苷激酶活性?xún)H為野生型 L-M 細(xì)胞的 1% 以下，導(dǎo)致無(wú)法利用外源性胸苷合成脫氧胸苷三磷酸（dTTP），必須依賴(lài)從頭合成途徑（由尿苷酸合成 dTTP）。同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，1?C - 胸苷摻入 DNA 的量?jī)H為野生型細(xì)胞的 0.5%，而 1?C - 尿苷摻入量增加 20%，補(bǔ)償了補(bǔ)救途徑的缺陷。當(dāng)從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷（HAT 培養(yǎng)基中），因無(wú)法利用胸苷，DNA 合成停滯導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這一機(jī)制是 HAT 篩選的理論基礎(chǔ)。與其他嘧啶代謝缺陷細(xì)胞系相比，其代謝表型更穩(wěn)定，無(wú)回復(fù)突變（突變率＜10??）。
在藥物篩選應(yīng)用中，該細(xì)胞系是抗代謝藥物研究的重要工具。基于其代謝特性，可用于區(qū)分藥物對(duì)從頭合成途徑與補(bǔ)救途徑的抑制作用，例如甲an蝶呤（抑制從頭合成）對(duì)其 IC50 為 0.1μM，顯著低于野生型細(xì)胞（IC50 1μM），而胸苷類(lèi)似物（抑制補(bǔ)救途徑）對(duì)其 IC50 則顯著高于野生型細(xì)胞（差異達(dá) 10 倍）。在抗病du藥物篩選中，其對(duì) HSV 胸苷激酶激活的前體藥物（如阿xi洛韋）敏感性較低（IC50 是野生型細(xì)胞的 5 倍），可用于評(píng)估藥物的 TK 依賴(lài)性。
基因編輯研究中，L-M (TK?) 細(xì)胞是同源重組實(shí)驗(yàn)的理想模型。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)靶向?qū)?TK 基因，可使 HAT 抗性克隆的同源重組效率達(dá) 5×10??，顯著高于非同源末端連接效率（1×10??）。利用該細(xì)胞系成功構(gòu)建了多種基因敲除模型，如敲除 p53 基因后，細(xì)胞對(duì)輻射的抗性增加 3 倍，證明其在基因功能研究中的價(jià)值。與胚胎干細(xì)胞相比，其培養(yǎng)更簡(jiǎn)便，無(wú)需飼養(yǎng)層細(xì)胞，適合高通量基因編輯實(shí)驗(yàn)。
在生物制藥應(yīng)用中，該細(xì)胞系可用于生產(chǎn)重組蛋白。轉(zhuǎn)染人干擾素 -β 基因后，細(xì)胞分泌量達(dá) 500IU/mL?24h，顯著高于原代細(xì)胞，且蛋白糖基化模式與天然蛋白一致。因無(wú)內(nèi)源性病毒污染，符合生物制品生產(chǎn)的安全標(biāo)準(zhǔn)，已用于多種細(xì)胞因子的小規(guī)模制備。其貼壁生長(zhǎng)特性適合微載體大規(guī)模培養(yǎng)，在攪拌式生物反應(yīng)器中密度可達(dá) 1×10?細(xì)胞 /mL，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了潛力。
腫瘤轉(zhuǎn)化研究顯示，該細(xì)胞系保留一定的惡性轉(zhuǎn)化潛能。經(jīng)甲基膽蒽處理后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切危鲋乘俾始涌欤ū对鰰r(shí)間縮短至 35 小時(shí)），軟瓊脂克隆形成率提升至 40%，接種裸鼠后成瘤率達(dá) 60%，證實(shí)其可作為化學(xué)致癌劑篩選模型。與其他永生化細(xì)胞系相比，其轉(zhuǎn)化表型更易檢測(cè)，適合早期致癌機(jī)制研究。
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