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詳細介紹
來源與克隆背景:該細胞系源自 20 世紀 70 年代分離的非洲綠猴腎原代細胞,通過極限稀釋法篩選獲得單克隆株(“GL" 代表shen源組織特性)。篩選過程以腸道病毒敏感性為核心指標,未引入外源基因,全基因組測序顯示其染色體數目為 60(近二倍體),與非洲綠猴腎原代細胞遺傳相似度>97%,核型穩定性在傳代 100 次內畸變率<2%,群體均一性優于早期混合株(流式檢測 G1 期細胞比例偏差<5%)。
形態與增殖:體外培養呈典型上皮樣形態,貼壁生長時呈短梭形或多邊形,胞質透亮,細胞排列較 VERO-76 疏松;懸浮培養易聚集成小團(直徑 30-50μm),以貼壁培養為主。37℃、5% CO?條件下,增殖周期約 28-32 小時,適應含 10% 胎牛血清的 MEM 培養基,傳代 80 次以上生長速率衰減<10%,凍存復蘇后存活率超 87%,無血清馴化后細胞密度可達 3.5×10?個 /cm2。
功能特征:核心優勢在于腸道病毒受體高表達與復制支持能力:脊髓灰質炎病毒受體(PVR)表達量較普通猴腎細胞高 3 倍(免疫印跡檢測),柯薩奇病毒 - 腺病毒受體(CAR)陽性率>90%(流式檢測)。感染脊髓灰質炎病毒 Ⅰ 型后 72 小時,病毒滴度可達 10?-10? PFU/mL,較 VERO-76 細胞高 1-2 個數量級;感染柯薩奇 B 組病毒后 48 小時,細胞病變(CPE)率達 95%,表現為細胞圓縮、脫落,顯著快于其他猴腎細胞系。
腸道病毒分離與鑒定
腸道病毒疫苗研發與生產
抗病du藥物篩選與評價
貼壁培養操作:
復蘇:凍存管 37℃水浴 1 分鐘解凍,轉移至含 10mL 預熱培養基(MEM+10% 胎牛血清)的離心管,1000rpm 離心 5 分鐘,重懸后接種至 T75 瓶,37℃、5% CO?培養,24 小時貼壁率超 90%。
換液:接種 48 小時后首ci換液,去除代謝廢物,此后每 2-3 天換液一次,維持細胞密度在 1×10?-6×10?個 /cm2(密度過高會降低腸道病毒敏感性)。
傳代:融合度達 75% 時,棄培養基,PBS 清洗 2 次,加 2mL 細胞解離液,37℃孵育 2 分鐘,鏡檢細胞脫落后加 8mL 培養基終止,按 1:5 比例傳代,避免過度融合導致受體表達下調。
病毒培養流程:
接種準備:將細胞以 1×10?個 / 孔接種 24 孔板,培養 24 小時至融合度 70%,接種前用無血清培養基洗滌 2 次。
病毒感染:加入 100μL 系列稀釋的腸道病毒液(如脊髓灰質炎病毒懸液),37℃吸附 1 小時,期間每 15 分鐘輕搖一次,吸棄病毒液后加含 2% 血清的維持液。
觀察與收獲:脊髓灰質炎病毒感染后 48-72 小時觀察 CPE,待 80% 細胞病變時收獲上清,-80℃凍存,通過空斑法或 RT-PCR 測定病毒滴度。
凍存流程:取對數生長期細胞,1000rpm 離心 5 分鐘,凍存液(70% MEM+20% 胎牛血清 + 10% DMSO)重懸至 5×10?個 /mL,分裝凍存管,程序降溫盒 - 80℃過夜后移至液氮,保存期超 5 年,復蘇后傳代 2 次再用于病毒實驗(確保受體表達穩定)。
優勢:對腸道病毒(尤其脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒)敏感性ji高(滴度較普通猴腎細胞高 1-2 個數量級);遺傳背景穩定,實驗重復性好(CV<6%);符合 GMP 標準,無內源性病毒污染;可適應無血清培養,便于工業化生產;病毒復制周期短,病變特征典型,易于觀察。
局限性:對包膜病毒(如狂犬病毒)敏感性較低;貼壁依賴性強,懸浮培養難度高于 CHO 細胞;長期傳代(>100 次)可能出現 PVR 受體表達下調(約 12%);缺乏干擾素合成能力,可能高估藥物體內抗病毒效果。
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