A-9 [A9]小鼠皮下結(jié)締組織細胞系
A-9 [A9]小鼠皮下結(jié)締組織細胞系源自 C3H 小鼠的皮下疏松結(jié)締組織，是經(jīng)化學(xué)誘變獲得的胸苷激酶（TK）缺陷型成纖維細胞模型，在基因互補研究、輻射敏感性測試及嘧啶代謝通路解析中具有不可替代的價值，其du特的代謝缺陷使其成為 HAT 選擇系統(tǒng)的經(jīng)典工具細胞，為哺乳動物細胞遺傳學(xué)研究提供了標準化模型。
該細胞系呈現(xiàn)典型的成纖維細胞形態(tài)與間葉組織表型。顯微鏡下，細胞呈長梭形或星形，貼壁生長，排列呈放射狀或漩渦狀，細胞長徑約 25-40μm，寬約 8-12μm，核質(zhì)比適中，細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)呈細顆粒狀，可見 1-2 個清晰核仁，核分裂象每 10 個高倍視野 2-3 個，胞質(zhì)豐富，呈弱嗜堿性，可見細長胞質(zhì)突起相互連接成網(wǎng)狀。電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲束，符合成纖維細胞的超微結(jié)構(gòu)特征，與野生型細胞相比，無明顯形態(tài)差異。免疫表型分析顯示，細胞高表達 vimentin（陽性率 98%）和 fibronectin（陽性率 95%），不表達上皮標志物 CK18 和內(nèi)皮標志物 CD31，證實其純結(jié)締組織來源，流式細胞術(shù)檢測顯示其染色體核型為小鼠正常核型（40 條染色體），但存在 1 號染色體長臂微小缺失（與 TK 基因定位區(qū)域一致）。
體外培養(yǎng)體系中，A-9 細胞的核心特征是胸苷激酶缺陷導(dǎo)致的代謝特殊性。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基（添加非必需氨基酸），在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 72 小時，倍增時間約 50 小時，與正常成纖維細胞增殖速率接近。其關(guān)鍵特性是無法利用外源性胸苷合成 DNA，在含 HAT（次黃piao呤、氨基蝶呤、胸苷）的選擇培養(yǎng)基中 48 小時內(nèi)全部死亡（死亡率 100%），而在普通培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，這種代謝缺陷使其成為基因轉(zhuǎn)移實驗的理想受體細胞 —— 當導(dǎo)入含 TK 基因的外源 DNA 后，陽性細胞可在 HAT 培養(yǎng)基中存活，篩選效率達 10??，顯著高于其他選擇系統(tǒng)。與野生型細胞相比，其在含 5 - 溴脫氧尿苷（BrdU）的培養(yǎng)基中存活率更高（85% vs 10%），因無法將 BrdU 摻入 DNA，避免了嘧啶類似物的毒性作用。
培養(yǎng)操作需注意其貼壁依賴性和代謝特性。傳代時需用 0.25% 胰dan白酶 - EDTA 消化 2-3 分鐘（較野生型細胞稍長），鏡下觀察細胞變圓后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打時需輕柔避免細胞損傷，傳代比例以 1:3 為宜，過高密度易導(dǎo)致細胞形態(tài)改變。凍存時采用含 10% DMSO 的wan全培養(yǎng)基，梯度降溫后保存于液氮，復(fù)蘇存活率達 90% 以上，復(fù)蘇后 24 小時需更換培養(yǎng)基去除死細胞。因代謝缺陷，培養(yǎng)基中需保證充足的谷an酰胺（2mM）和葡萄糖（4.5g/L），以滿足從頭合成途徑的需求，定期檢測培養(yǎng)基 pH 值（維持 7.2-7.4），酸性環(huán)境（pH＜7.0）會顯著抑制其增殖。
輻射敏感性研究顯示，A-9 細胞是檢測電離輻射效應(yīng)的理想模型。其對 X 射線和 γ 射線的敏感性顯著高于野生型細胞，LD50（致死劑量 50%）為 2Gy，而野生型細胞為 4Gy，輻射后 DNA 損傷修復(fù)速率較慢（γ-H2AX 焦點消失時間延長 2 倍），這與 TK 缺陷導(dǎo)致的 DNA 合成原料供應(yīng)不足相關(guān)。輻射可誘導(dǎo)其 G2/M 期阻滯（阻滯率達 60%），顯著高于野生型細胞（30%），p53 蛋白表達量在輻射后增加 5 倍，凋亡率達 35%（野生型細胞 20%），這種高敏感性使其廣泛用于輻射防護劑和放射增敏劑的篩選。
基因互補實驗中，該細胞系是驗證 TK 基因功能的標準工具。將小鼠 TK cDNA 導(dǎo)入細胞后，陽性克隆可在 HAT 培養(yǎng)基中存活，TK 酶活性恢復(fù)至野生型細胞的 80%，嘧啶代謝通路恢復(fù)正常，1?C - 胸苷摻入量從 0.1% 提升至 90%（與野生型相當）。這種互補實驗不僅證實了 TK 基因的功能，還為研究基因表達調(diào)控提供了模型，啟動子強度檢測顯示，SV40 啟動子驅(qū)動的 TK 表達效率是 β- 肌動蛋白啟動子的 3 倍，為載體構(gòu)建提供了參考數(shù)據(jù)。與其他缺陷型細胞系相比，其基因表達背景更穩(wěn)定，無內(nèi)源性 TK 活性干擾，實驗重復(fù)性好（變異系數(shù)＜5%）。
在嘧啶代謝研究中，A-9 細胞為解析補救途徑與從頭合成途徑的關(guān)系提供了du特視角。同位素標記實驗證實，其 DNA 合成所需的脫氧胸苷三磷酸（dTTP）wan全依賴從頭合成途徑（由尿苷酸經(jīng)胸苷酸合酶催化生成），當從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷（HAT 培養(yǎng)基中），因無法利用補救途徑，導(dǎo)致 dTTP 耗盡，DNA 復(fù)制停止。代謝流分析顯示，其尿苷攝取速率是野生型細胞的 1.5 倍，補償了補救途徑的缺陷，谷an酰胺消耗增加 20%，為嘧啶環(huán)合成提供氮源。這種代謝特征使其成為研究胸苷酸合酶抑制劑（如氟尿*啶）作用機制的理想模型，藥物敏感性實驗顯示其對氟尿*啶的 IC50 為 0.5μM，顯著低于野生型細胞（5μM），因無法通過補救途徑繞過抑制作用。
生物制藥應(yīng)用中，該細胞系可用于生產(chǎn)重組蛋白。因其無內(nèi)源性病毒污染且代謝表型穩(wěn)定，被用于表達多種細胞因子，轉(zhuǎn)染人白細胞介素 - 2 基因后，分泌量達 300IU/mL?24h，蛋白活性與天然產(chǎn)物一致。通過 HAT 篩選系統(tǒng)可高效獲得穩(wěn)定表達株，陽性克隆比例達 5%，顯著高于隨機整合（0.1%）。其貼壁生長特性適合微載體培養(yǎng)，在攪拌式生物反應(yīng)器中細胞密度可達 8×10?細胞 /mL，為中小規(guī)模重組蛋白生產(chǎn)提供了經(jīng)濟高效的選擇。
輻射遺傳學(xué)研究中，A-9 細胞的染色體畸變率可作為輻射劑量的生物標志物。在 0.5-5Gy 范圍內(nèi)，染色體斷裂數(shù)與輻射劑量呈線性正相關(guān)（r=0.98），畸變類型以雙著絲粒和環(huán)狀染色體為主，這種劑量 - 效應(yīng)關(guān)系被用于建立輻射生物劑量模型，與物理劑量計的偏差＜10%。與淋巴細胞相比，其體外培養(yǎng)更簡便，可長期保存用于回顧性劑量重建，已在放射事故劑量評估中得到應(yīng)用。
細胞毒性測試中，該細胞系被用于評估嘧啶類似物的特異性毒性。基于其無法利用補救途徑的特性，可區(qū)分藥物對從頭合成途徑的選擇性抑制作用，某新型胸苷酸合酶抑制劑對其 IC50 為 0.3μM，而對 TK 陽性細胞的 IC50 為 3μM，顯示出良好的靶向性，這種篩選模型可減少假陽性化合物的干擾，提高藥物研發(fā)效率。
以上信息僅供參考，詳細信息請聯(lián)系我們。
首頁-產(chǎn)品系統(tǒng)-細胞-細胞系-BY-0802A-9 A9小鼠皮下結(jié)締組織細胞系
詳細介紹
產(chǎn)品咨詢
聯(lián)系我們
